La génotoxicité

Relation avec la biodiversité

Adapté de : M. Laulier, S. Lemoine, F. Denis. Laboratoire de Biologie et Génétique Évolutive, Université du Maine. Faculté des Sciences, Avenue O. Messiaen, Le Mans 72085 Cedex 9, laulier@univ.lemans.fr.

Introduction

Face aux polluants en général et métalliques en particulier, les organismes marins peuvent développer des tolérances aux micropolluants et l'on parle alors de stratégies adaptatives des mollusques marins.  Par contre, certains micropolluants peuvent développer des effets toxiques auprès du bagage génétique des organismes exposés. On parle alors de génotoxicité. 

Toutefois, les populations végétales et animales sauvages restent inféodées au potentiel d’adaptation au milieu que leur confère  leur patrimoine génétique.  Les altérations génétiques qui peuvent survenir suite à l’exposition chronique ou aiguë à des polluants représentent donc un facteur très important chez ces populations si elles aboutissent à modifier leur dynamique et leurs capacités d’adaptation.

Dans toutes les cellules vivantes, qu’elles soient végétales ou animales, la structure moléculaire qui contient ce patrimoine génétique est l’acide désoxyribonucléique (ADN).  Cette macromolécule présente une structure complexe qui peut être modifiée par des agents toxiques, ils sont alors appelés génotoxiques.  Ces agents peuvent être de nature physique ou chimique.   On peut alors mettre en évidence ces modifications structurales par l’analyse directe de l’ADN ou par l’examen des traductions fonctionnelles. 

L’aptitude à survivre en présence de polluants métalliques peut être corrélée au génotype. L’indice de Nei (non biaisé), peut être utilisé pour comparer les fréquences alléliques des allozymes de populations naturelles ou expérimentales. L’analyse des dendrogrammes peut alors mettre en évidence des modifications de la constitution génétique des populations en présence de mercure alors que l’argent modifie peu les fréquences alléliques. De tels résultats démontrent le rôle adaptatif de certains génotypes.

Une autre approche repose sur l’analyse de l’expression de gènes codant pour des protéines dont la synthèse est augmentée en présence de métaux. Cette approche permet de montrer que certains gènes codant pour les métallothionéines sont activés quelque soit le métal et que d’autres répondent de manière spécifique lorsque les organismes sont exposés aux métaux.

Chez les mollusques,  une grande variabilité de réponses a été observée vis à vis des polluants métalliques (Amiard.-Triquet, 1989). Chez de nombreuses espèces, on note que les résultats observés sont fonction de l’origine des individus (Bryan et al , 1980; Amiard et al,1987; Amiard, 1991).  De plus, des corrélations sont évidentes entre la tolérance des organismes vivants et le degré de contamination par les métaux des zones de prélèvement (Hummel et a!, 1996).  

La tolérance peut reposer sur plusieurs processus probablement non exclusifs. Elle peut être acquise grâce à des réponses de type physiologique. Dans ces conditions cette aptitude ne sera pas transmise aux descendants. Elle peut aussi résulter d’une adaptation génétique, la pression de sélection favorisant certains génotypes. Cette aptitude à la résistance sera alors transmise aux descendants et la constitution génétique des populations pourra être modifiée.

Le problème et l’approche méthodologique

L’analyse génétique de l’adaptation des individus face à un polluant peut reposer sur l’étude de la population via le génome, en prenant en compte soit des gènes dont le rôle dans la réponse au toxique a été établi soit un ensemble de gènes considérés comme représentatifs de l’ensemble du génome, leurs relations avec la réponse au polluant n’étant pas établie.

Dans le cas de l’analyse des populations, deux mécanismes fondamentalement différents peuvent induire des modifications dans la constitution génétique des populations.

  • Le premier est le résultat de l’élimination drastique et aléatoire des effectifs (bottleneck ou goulot d’étranglement),

  • le second est lié à l’élimination de certains-génotypes ou phénotypes sous l’action de facteurs sélectifs, ce phénomène est alors adaptatif.

Si chacun de ces mécanismes peut modifier la constitution génétique de la population, leur signification est très différente.

Pour estimer les modifications induites au niveau de la population, il est nécessaire d’estimer la variabilité génétique. Cette approche repose sur l’analyse du polymorphisme. L’établissement des séquences nucléotidiques, les techniques de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplifled Polymorphic DNA) et l’étude des allozymes constituent des moyens appropriés pour aborder ce problème. En raison de son antériorité historique, et de la facilité de mise en œuvre,  l’étude des allozymes  est privilégiée.  La révélation et la reconnaissance des allozymes reposent sur leurs propriétés physiques et en particulier leurs propriétés électrophorétiques.

Le deuxième type d’approche repose non pas sur l’analyse du génome dans sa globalité mais sur la comparaison de la structure et du fonctionnement de gènes intervenant ou étant supposés intervenir dans les processus de détoxication. Les études portant sur le gène des métallothionéines sont particulièrement intéressantes grâce à leur capacité de devenir des biomarqueurs d’exposition aux métaux.

Effets de la réduction des effectifs.

L’exposition aux toxiques peut entraîner une diminution sévère des effectifs. Ceci peut conduire à des modifications notables des fréquences alléliques et par suite génotypiques. Il est cependant difficile d’établir que les résultats observés sont la conséquence d’une réduction drastique des effectifs. Pour analyser ce type de phénomène, il serait nécessaire de comparer les fréquences alléliques - et génotypiques de populations exposées à des contaminations semblables conduisant à une chute sévère des effectifs, Si les fréquences diffèrent notablement, la réduction des effectifs pourra être avancée comme explication.

Contaminants métalliques et sélection.

L’utilisation des allozymes représente un moyen rapide permettant d’analyser la constitution génétique des populations.

Les études de la variabilité fondée sur les allozymes ont engendré un débat de fond. La sélection s'exerce-t-elle sur les allozymes ou les allozymes sont elles sélectivement neutres? La sélection due à la présence de métaux peut-elle induire des modifications de la structure génétique des populations?

La mesure de la variabilité génétique repose de manière courante sur l’estimation de trois paramètres:

  • le nombre moyen d’allèles par locus

  • la-proportion de locus polymorphes

  • l’hétérozygotie théorique moyenne “H” qui est la moyenne des valeurs h = 1-Sqi2 ou qui représente la fréquence du ième allèle.

Il est à noter que ces trois paramètres varient en général dans le même sens. Il a été établi que la diversité génétique des populations varie considérablement en fonction de leur localisation.

Certains auteurs se sont alors interrogés sur l’existence d’une relation entre diversité génétique et résistance aux pollutions (Nevo et al., 1986). Six espèces de gastéropodes appartenant à trois genres ont été étudiées et classées en fonction de leur hétérozygotie.

Trois de ces espèces sont caractérisées par une forte hétérozygotie, Monodonta turbiformis, Littorina neritoïdes et Cerithium scabridum. Les trois autres M. turbinata, L. punctata et C. rupestre sont caractérisées par une faible hétérozygotie.

Des tests de survie ont été réalisés après exposition aux métaux lourds. Le pourcentage de survivants a été établi en prenant en compte le jour ou pour une espèce, le pourcentage d’individus morts dépasse 50% (soit environ 7 jours).

Les observations démontrent que les espèces caractérisées par la plus forte variabilité génétique sont celles qui résistent le mieux aux différents polluants.

Au niveau intraspécifique, ces observations sont à rapprocher de celles réalisées chez Macoma balthica et Crassostrea gigas. Chez Macoma balthica, il a été démontré que les populations les plus proches des limites de répartition sont les moins polymorphes mais aussi les moins résistantes (Hummel et a!, 1996). Chez Crassostrea gigas, les animaux hétérozygotes sont plus sensibles aux stress associés aux polluants (Moraga et al., 1995)

Une corrélation entre résistance et variabilité étant établie, on peut s’interroger sur la présence de génotypes caractérisés par une plus forte valeur adaptative vis à vis des polluants. Deux approches non exclusives, au laboratoire et en milieu naturel peuvent être développées.

Au laboratoire, la démarche repose sur la recherche de l’existence de différences entre les génotypes des individus survivants et celui des individus morts lorsque la létalité atteint 50%. Pour mettre en oeuvre cette démarche, il est nécessaire que la population d’origine soit très polymorphe (pour permettre un traitement statistique), que les enzymes soient révélables à partir d’animaux morts et que l’interprétation ne soit pas sujette à contestation.

Les études chez Littorina punctata et Littorina neritoïdes (Lavie et al, 1987) portent sur les modifications des fréquences alléliques induites par la présence de mercure, de cadmium ou d’un mélange mercure - cadmium. Deux enzymes, PGI (phospho glucose isomérase) et LAP (leucine amino peptidase) ont été étudiées. Les différents allèles ont été reconnus et nommés en fonction de leur vitesse de migration.

Il a été montré que la fréquence de certains génotypes augmentent lorsque les animaux sont exposés au mercure ou au cadmium, d’autres augmentent en présence du mélange mercure - cadmium. Certains génotypes sont éliminés en présence de mercure, de cadmium ou du mélange de ces deux métaux. On note que la tendance est à l’élimination de l’un des allèles et que le mercure et le cadmium contre-sélectionnent les hétérozygotes.

Plus que l’élimination qui peut correspondre à des génotypes de fréquence initiale faible, on retiendra que dans plusieurs cas les différences observées sont statistiquement significatives.

Le même type d’analyse pour la LAI’ met en évidence des conclusions similaire.

La conclusion la plus évidente, est que la survie des individus dépend de leur génotype. Chaque polluant affecte la distribution des allozymes. L’interaction (Hg Cd) n’est pas additive, le mélange agit corne une entité indépendante.

On observe une survie différentielle associée à la nature des associations alléliques au sein du génome.

Il est à noter que ces différences peuvent être dues aux gènes étudiés ou à des gênes liés qui sont les vrais responsables de la réponse aux facteurs sélectifs. Les gènes étudiés correspondent alors à des marqueurs.

Des travaux réalisés chez d’autres espèces de mollusques conduisent à des conclusions similaires. Chez Macoma balthica, des différences statistiquement significatives ont été mises en évidence pour les loci de la GPI, de la PGM (phospho gluco mutase), et de la LAI’ (Amiard-Triquet, 1996). De même chez Crassostrea gigas, la tolérance de certains individus au cadmium-et au cuivre a été corrélée à leurs caractéristiques génotypiques et alléliques

L’ensemble des résultats observés pour des “populations expérimentales” permet de considérer que les métaux lourds peuvent induire des modifications des fréquences génotypiques et alléliques.

Suite à ces travaux, l’intérêt de la comparaison de ces données avec celles observées en milieu naturel devient évident. Le travail le mieux documenté a été réalisé chez 2 espèces de littorines (Littorina punctata et L. neritoïdes).

Dans les conditions expérimentales (Lavie et al., 1987) il a été montré que certains allèles de la GPI et de la LAP ont tendance à être éliminés lors d’expositions au mercure, Les fréquences alléliques de la GPI et de la LAP de 8 populations naturelles ont été établies (Nevo et al,. 1987). Sept de ces populations sont considérées comme non “polluées” et une d’entre elles (Akko) comme polluée par le mercure.

On note que les fréquences des différents allèles de la GPI et de la LAP’ observées dans tes conditions naturelles sont conformes à ceux attendus si l’on se réfère aux résultats expérimentaux. Les allèles sensibles à l’exposition au mercure sont ceux qui présente les fréquences les plus faibles dans la population de Akko.

Ces résultats vont à l’encontre des résultats attendus dans le cadre de la théorie neutraliste.

Ces résultats appellent cependant quelques remarques et critiques.

Dans toutes les études citées précédemment, on constate qu’une des enzymes étudiées est la LAP. Des travaux portant sur la répartition géographique (Koehn et al., 1976), l’analyse expérimentale (Beaumont et aL, 1988)> et l’activité enzymatique (Hilbish et ai., 1985) des allozymes de la LAI’ ont montré que la valeur adaptative des allèles observés pour cette enzyme est fonction de la salinité, L’influence de la concentration en osmolytes inorganiques sur l’activité enzymatique de la LAP a été démontrée. La présence de NaCl dans le milieu réactionnel entraîne une perturbation de type compétitif Cette sensibilité peut être due à l’influence cationique du sel ou à sa force ionique (Denis. 1995). Il convient donc d’être prudent et de s’interroger sur la nature du facteur sélectif, salinité ou résistance aux polluants. Ceci conduit à s’interroger d’une manière plus générale sur la nature des mécanismes qui conduisent à la sélection de certains génotypes.

Une hypothèse fréquemment avancée est le comportement différent des allozymes face au métal considéré comme inhibiteur. On pense que les métaux lourds agiraient en s’incorporant au niveau des différents sites enzymatiques. Ceci modifierait ou inhiberait l’activité enzymatique. Dans cette hypothèse, les résultats exposés par Névo pourraient être expliqués de la manière suivante. Les allozymes ne se complexeraient pas de la même manière avec le mercure ou le cadmium et l’interaction des 2 éléments mercure et cadmium provoquerait une réponse spécifique.

En fait il n’existe pas à notre connaissance de travaux mettant en évidence des inhibitions de ce type. Par contre des différence métaboliques ont été mises en évidence (Kramer, 1992). Elles concernent essentiellement la glycolyse et le cycle de Krebs mais la relation entre les deux phénomènes n’est pas clairement établie contrairement à ce qui concerne la valeur adaptative des différentes allozymes de la LAP en fonction de la salinité.

La LAP joue un rôle fondamental dans le mécanisme de libération des acides aminés. Ces acides aminés interviennent dans les processus de régulation osmotique lorsque les animaux sont soumis à des variations de salinité, En milieu hypoosmotique les bivalves réduisent leur volume cellulaire en libérant des acides aminés qui transportés par l’hémolymphe sont libérés sous forme libre ou sous forme d’ammoniaque. En milieu hyperosmotique, il y a accumulation des acides aminés libres intracellulaires. Les travaux de Hilbish ont montré que l’un des allèles, caractérisé par un taux d’activité supérieur aux autres allèles est contre sélectionné aux basses salinités (Hilbish et al,1985).

Ces résultats expérimentaux confirment la validité de l’hypothèse dune valeur sélective différente des allèles de la LAP en fonction de la salinité.

Les résultats exposés mettent en évidence, aussi bien dans les conditions expérimentales que naturelles une corrélation entre fréquence alléliques et / ou génotypiques. Cependant d’autres variables environnementales rarement analysées devraient être prises en compte.

Les études présentées jusqu’ici prennent en compte les variations de fréquences des gènes étudiées individuellement,

Ont été  analysées chez Macoma balthica les conséquences de l’exposition aux métaux lourds (mercure et argent) en prenant en compte l’ensemble des données obtenues lors du calcul des fréquences alléliques. Cette étude porte sur trois types d’activité (GPI, PGM et LAP ou deux locus LAP1 et LAP2 ont été mis en évidence). À partir de ces données, nous avons calculé l’indice de Nei (Nei 1972; 1978).

Ou Px est la probabilité d’identité de 2 gènes pris au hasard dans la population x

Ou Py est la probabilité d’identité de 2 gènes pris au hasard dans la population y

Ou Pxy est la probabilité d’identité de 2 gènes, 1 choisi dans x l’autre dans y

À partir de ces valeurs, nous avons tracé un dendrogramme en utilisant le programme BIOSYS-l (Swofford et al., 1981). Ce dendrogramme prend en compte les fréquences alléliques d’animaux exposés au mercure et provenant de la baie de Somme (HGS) et de l’estuaire de la Loire (HGL), de ceux exposés à l’argent et provenant de la baie de Somme (AGS) et de l’estuaire de la Loire (AGL) ainsi que des témoins prélevés en baie de Somme (TBS) et dans l’estuaire de la Loire (TL) Une autre population (MAH) provenant de l’estuaire de la Seine a été étudiée.

Le dendrogramme obtenu permet de constater que le premier niveau isole deux sous-ensembles. Le premier est constitué par les animaux provenant de la baie de Seine et ceux exposés à l’argent. Le second par des animaux provenant de l’estuaire de la Loire, de la baie de Somme et ceux exposés au mercure.

Dans le premier sous ensemble les animaux de la baie de Seine (MAH) sont bien isolés de ceux exposés à l’argent.

En ce qui concerne la partie supérieure du cladogramme, les similitudes sont plus fortes et relèvent plus de l’origine du prélèvement que de la nature du polluant.

L’utilisation de l’indice de Nei permet de conclure que l’argent induit des modifications notables des fréquences alléliques. Le mercure induit peu de modifications et ces différences ne masquent pas celles liées à l’origine des animaux.

Un élément intéressant est l’apparente identité des animaux de la baie de Seine et ceux intoxiqués par l’argent. Cette similitude est à rapprocher de ce qui est observé dans les trois sites considérés. La comparaison des degrés de contamination des trois estuaires démontre que la différence la plus marquante concerne la teneur en argent qui est 50 fois plus importante dans la baie de Seine qu’en baie de Somme et 8 fois plus que dans l’estuaire de la Loire.

Les observations réalisées sur site confirmeraient le rôle sélectif de certains métaux en ce qui concerne l’adaptation des populations à leur environnement.

Conclusion

L’analyse de la variabilité génétique à partir de la fréquences des allozymes apparaît comme un moyen d’appréhender les problèmes liés à la pollution. Les résultats doivent cependant être analysés avec prudence et les conclusions largement discutées. Les métaux semblent bien jouer un rôle sélectif mais d’autres variables environnementales peuvent être à l’origine des différences observées, Il est aussi évident que a constitution génétique de la population originelle n’est pas sans influence sur les fréquences observées.

Il apparaît donc nécessaire de mettre en oeuvre un maximum de démarches expérimentales afin de confirmer ou d’infirmer les observations réalisées en laboratoire. L’aspect méthodologique doit cependant être revu en particulier au niveau des doses utilisées. Celles-ci sont fréquemment supérieures d’un facteur 1000, de l’ordre du Eg par litreLlpar rapport à celles observées dans les conditions naturelles qui sont de l’ordre du ng par litre.

L’utilisation des mollusques peut être discutée elle aussi. Les mollusques et en particulier les filtreurs sont intéressants dans la mesure où ils accumulent les éléments polluants. Toutefois, la durée d’une génération chez les mollusques étudiés est longue (environ un an) les études citées n’ont pas permis l’étude des descendances. Or il est à penser que la valeur sélective d’un gène varie en fonction de l’âge des individus et plus particulièrement en-fonction des différents stades lorsque l’espèce est caractérisée par l’existence de phases larvaires.

Les études expérimentales portent sur la détermination des génotypes d’individus résistants (vivants) ou sensibles (morts). Il serait intéressant de déterminer les génotypes des individus et de comparer leurs réponse face au polluants à partir d’indices permettant d’appréhender leur réponse au sens physiologique soit de manière particulière (aptitude à la reproduction) ou de manière globale.

Des indices tels que la Charge Énergétique Adénylique (AEC) pourraient être utilisés (Sylvestre et al., 1987)

Une faible valeur de l’AEC correspond d’après ces auteurs à une physiologie fortement altérée et leurs travaux ont montré globalement une réduction de I’AEC des animaux des zones polluées.

Il serait intéressant de comparer la constitution alléliques et génotypique de populations à haut et bas niveau d’AEC et, au niveau des populations d’identifier les génotypes caractérisés par des niveaux différents. L’étude des courbes proposées par ces auteurs suggère, au moins pour certaines populations l’existence de deux catégories d’individus (des animaux fortement perturbés et des animaux peu perturbés). La comparaison des génotypes des individus des différentes catégories supposées permettrait peut être de répondre à cette interrogation.

Les métallothionéines

Jusqu’ici nous avons envisagé l’étude des gènes pris dans sa totalité sans considérer à pilori qu’il existe une relation entre les enzymes étudiées et les phénomènes d’intoxication par les métaux lourds.

Il existe cependant des protéines naturellement présentes dans les organismes, les métallothionéines dont l’aptitude à complexer avec les métaux a été démontrée. Leurs rôles et leur structure ont été analysés chez de nombreux organismes. Les propriétés et caractéristiques propres aux mollusques ont été publiées dans une revue très documentée (Langston et al, 1998).

Il a été montré que le Zinc est l’inducteur primaire de ces molécules. Toutefois l’induction de la synthèse de ces protéines lors d’une exposition aux métaux lourds a été démontrée.

Les métallothionéines sont des protéines de faible poids moléculaire caractérisées par leur richesse en Cystéine (20 à 30 %) qui peuvent se complexer avec des métaux comme le Cd, Ag, Hg et Cu.

Ces protéines sont considérées comme jouant un rôle essentiel dans les mécanismes de régulation des métaux essentiels tels que le Zn et le Cu mais on considère également qu’elles constituent un moyen de protection contre les effets toxiques de métaux non essentiels (Cd, Hg).

Depuis la découverte de ces protéines de nombreux travaux ont été entrepris pour comprendre à la fois leur rôle dans la régulation des métaux essentiels mais aussi dans leur intervention face aux polluants métalliques.

On doit noter que l’induction de la synthèse des métallothionéines est sous la dépendance de nombreux autres facteurs, hormones, ou stress par exemple (Kägi, 1991) d’où une variabilité qui peut être liée à l’état physiologique des animaux étudiés. Chez C. virginica, il a été montré que la teneur en MT présente des fluctuations annuelles corrélées à l’état de maturité sexuelle à l’âge et à la taille (in Langston W.J. et al., 1998).

Ces protéines existent sous de nombreuses isoformes et ceci quelque soit l’espèce étudiée. Elles diffèrent entre elles par quelques acides aminés. La synthèse de certaines isoformes constitue une réponse spécifique à la présence de certains métaux, ce qui a conduit certains auteurs à les considérer comme des biomarqueurs. Cette observation justifie l’intérêt des recherches entreprises mais ne doit pas conduire ànégliger l’étude et la compréhension de leur rôle dans les conditions physiologiques normales.

La taille de ces protéines est très variable de 25 à 80 acides aminés. La caractéristique commune est la présence de doublets cystéine Cys-Cys ou de triplets Cys-X-Cys. Ces cystéines participent à la fixation des ions métalliques.

Pour les métallothionéines dont la structure spatiale a été établie on observe deux domaines entourant chacun un noyau métallique.

In vivo les métallothionéines contiennent toujours des ions métalliques plus particulièrement des métaux essentiels Zinc et Cuivre mais aussi du Cadmium et du mercure, métaux non essentiels.

Des expériences in vitro ont montré qu’il est possible de déplacer ces métaux puis de recharger l’apoprotéine. L’ordre d’affinité peut ainsi être établi Hg, Ag> Cu > Cd > Zn.

La quantification de ces protéines a fait l’objet de nombreux travaux utilisant différentes techniques.

Plus récemment les techniques de biologie moléculaire ont été mises en oeuvre pour quantifier les ARNm des métallothionéines dans les populations naturelles ou après intoxication par des métaux.

Les travaux suivants portent sur les métallothionéines (Mis) de moules (Mutilus edulis) et nous développerons essentiellement ce sujet.

Chez de nombreuses espèces, il a été montré que l’intoxication par des métaux conduit rapidement à une augmentation de la teneur en Mis. Cette augmentation est en général corrélée à une augmentation de la transcription des gènes des métallothionéines. Nous avons donc entrepris d’étudier la synthèse des ARNm des métallothionéines.

Chez--la moule deux catégories de métallothionéines- ont été décrites , MT 10 (10 1W, 72 acides aminés, 4 isoformes) et Mi 20 (20 k!) qui correspond à un dimère, chaque monomère étant constitué de 71 acides aminés dont 2 cystéines supplémentaires qui participeraient à la liaison des monomères ou augmenteraient la capacité de se complexer avec les métaux, 5 isoformes). Les séquences en acides aminés ont été établies (Mackay et al., 1993).

Des moules ont été exposées à de fortes doses de CdCl2 (100mg L-1) pendant 11 jours.  L’ARN des branchies a été extrait. Une RTPCR a été réalisée en utilisant comme amorce des séquences dérivées des séquences protéiques établies antérieurement (Mackay et al., 1993). Les fragments amplifiés ont été clonés puis séquencés.

La séquence obtenue correspond à une isoforme MT 20 Ia dont la séquence en acides aminés a été décrite(Mackay et al., 1993).

Une autre partie codante a été obtenue et séquencée après criblage dune banque de cDNA. Elle code pour une isoforme de type MT 10 IV.

Ces deux séquences ont permis la fabrication de sondes radioactives utilisées pour la réalisation des Northern (hybridation moléculaire ARN/ADN). Ces sondes ont ensuite été utilisées pour quantifier les ARNm transcrits lorsque -des moules sont élevées pendant 4 ou 21 jours dans un milieu contenant des métaux. Les concentrations utilisées sont de 200 mg L-1 pour le cadmium, 1000 mg L-1 pour le zinc et 40 mg L-1 pour le cuivre. Les études portent sur la glande digestive, les branchies et le manteau

Afin de rapporter nos estimations à une quantité d’ARN déposé standard, des Northern blots ont été réalisés avec une sonde d’ADN 28 S. L’expression de ce gène est considérée comme non régulée par les métaux.

Chez les témoins il n’existe apparemment pas de- synthèse des ARN messagers des MT 20. Le niveau basai d’expression est très faible voir nul. La présence de Cadmium dans le milieu provoque à court terme (4 jours) comme à long terme (21 jours) une forte induction de la synthèse de -ARN m de Mi 20. Cette augmentation de la transcription est observée dans les trois organes étudiés (Fig. 2). Elle est particulièrement marquée pour la branchie.

Le zinc et le cuivre ne provoquent pas d’augmentation de la transcription du gène MT 20.

Le niveau basaI de transcription du gène MT 10 est suffisant pour être détecté par hybridation. Il est plus important au niveau des branchies et de la glande digestive qu’au niveau du manteau.

L’exposition au cadmium provoque à court terme une forte augmentation de la transcription dans les trois organes, en particulier au niveau du manteau. À 21 jours, le niveau d’expression dans la glande digestive est revenu à son niveau de départ. Les niveaux de synthèse d’ARNm des MTs sont en baisse dans les deux autres tissus.

L’exposition au zinc provoque une forte augmentation de la transcription dans les trois organes aussi bien en cas d’exposition brève que longue.

Le niveau basal comme le niveau atteint après exposition est toujours plus élevé dans les branchies que dans la glande digestive ou la quantité d’ARNm est elle même plus élevée que dans la manteau.

Aucune induction n’a été observée lors des expositions au cuivre. L’activité de transcription semble même décroître. Cette observation confirme les observations réalisées chez Crassostrea et Ostrea ou il a été montré que le cuivre n’induisait pas d’augmentation de la synthèse des métallothionéines.

Conclusions

Ces résultats (Lemoine S. et al., à paraître) suggèrent que chacune des isoformes étudiées possède des fonctions différentes.

L’induction de la transcription est sous la dépendance de l’action de métaux différents et la réponse sans être totalement spécifique est liée à la nature du polluant. La métallothionéine de type MT 20 semble répondre de manière spécifique, le spectre des inducteurs des MT 10 semble plus large.

De nombreuses interrogations subsistent. Le séquençage a mis en évidence l’existence de plusieurs isoformes mais l’approche méthodologique qui repose sur l’utilisation de pools d’individus ne permet pas d’établir si ces molécules sont le résultat de l’expression d’allèles différents ou de gènes différents issus de duplications.

L’étude de populations naturelles permettra d’analyser l’expression de ces gènes dans des conditions correspondant à des - doses de métal plus faibles que celles utilisées dans nos conditions expérimentales. Ceci devrait permettre de confirmer ou d’infirmer l’intérêt d’utiliser les métallothionéines comme des marqueurs de contamination.

Il serait aussi intéressant d’étudier les mécanismes d’induction sous l’action combinée de plusieurs métaux afin de comprendre les interactions.

Sources

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modifié le mardi 01 mars 2005